葡萄成熟時，在果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，它們依靠葡萄分泌物生存，不同的酵母菌之間相互作用構成了一個平衡體系。葡萄破碎后酵母進入葡萄汁液中，在適當的溫度下，這些酵母菌將大量繁殖破壞原有的微生物平衡，這種條件下產生的發酵方式一般稱之為自然發酵。

　　在葡萄酒自然發酵過程中，不同的酵母發揮作用的時間不同，在發酵的初始階段由酒精耐受能力較低的非釀酒酵母來完成，如假絲酵母、克魯維酵母和漢森酵母等。研究表明，非釀酒酵母的生長有助于酒風味的形成，特別是甘油、酯類和高級醇等物質的產生對酒風味的形成具有積極的作用，但發酵1天—3天后非釀酒酵母逐漸被酒精耐受能力較高的釀酒酵母所取代。一般認為，釀酒酵母和非釀酒酵母的這種交替關系是由于菌種之間對外界環境的抵抗能力的差異造成的，比如酒精濃度的升高、有機酸的積累，pH的不斷降低以及營養物質的消耗等，都可能造成非釀酒酵母的衰亡。

　　一些研究表明，酵母在發酵規程中產生的一些代謝產物會抑制其它菌的生長，如中長鏈脂肪酸以及糖蛋白、多肽等，小分子量的信號分子等。也有一些研究表明釀酒酵母與非釀酒酵母間的交替作用并不是由于一些有毒物質代謝產物的分泌而產生的，而是由于在高細胞濃度下細胞間為爭奪生存空間造成的。非釀酒酵母存活時間的長短對葡萄酒風味物質的形成有著很大的影響。因此，找出酵母這種交替關系的形成機制成為葡萄酒釀造中一個急需解決的問題。

    　本實驗選擇葡萄皮表面一種常見的非釀酒酵母——克魯維酵母作為出發菌株，通過透析袋式發酵法，采用單因素實驗、發酵上清抑菌實驗以及雙向電泳等分析方法，考察外界環境變化對克魯維酵母生長的影響，探討克魯維酵母衰亡的原因。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1材料與方法

    　1.1材料 釀酒酵母，克魯維酵母，均由大連工業大學菌種保藏中心提供。培養基采用全合成培養基，pH3.3，葡萄糖200g，檸檬酸6 g，DL—蘋果酸6 g，KH2PO4 750mg，K2SO4 500mg，MgSO4·7H2O 250 mg，CaCl2·2H2O 155mg，NaCl200mg，MnSO4·H2O 4mg ZnSO4 4mg，CuSO4·5H2O 1mg，KI 1mg, CaCl2·6H2O 400ug，H3BO3 1mg，（NH4）6Mo7O24·2H2O 1mg，NH4Cl300mg YNB 3.3g，經110℃、20min殺菌。

    　1.2 方法

    　1.2.1 克魯維酵母生長曲線的測定方法

    　克魯維酵母生長變化情況通過平板計數法測定：直接將菌適當稀釋后涂布于YPDA培養基中（5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g葡萄糖、瓊脂粉20g pH5.6），28℃培養3天，計數。

    　1.2.2 殘糖的測定方法

    　發酵液中殘糖的測定采用3，5—二硝基水楊酸法

    　1.2.3 酒精濃度的測定

    　發酵第4天酒精濃度的測定采用試劑盒法

    　1.2.4 發酵方法

    　釀酒酵母和克魯維酵母純培養：直接將種子液接種到預先準備好的SM培養基中，接種濃度1×104CFU/ml。

    　透析袋發酵：采用截留分子量為10kDa的透析袋，將克魯維酵母接種于透析袋內，將釀酒酵母接種于透析袋外側，接種的濃度均為1×104CFU/ml。透析袋經110℃、20min 殺菌，每6天更換1次。

    　1.2.5 誘導因素的單因素實驗

    　酒精、pH對衰亡誘導作用的確定方法：取新鮮的SM培養基，調節酒精度至43g/l，PH23（透析發酵第4天時的酒精濃度及pH），接入克魯維酵母，接種濃度為1×104CFU/ml，28℃下靜置培養，觀察其生長的變化。

    　上清液對克魯維酵母衰亡的誘導作用：取發酵4天的透析袋外側發酵液，經10000r/min，10min離心取上清液，然后接入克魯維酵母，接種濃度為1×104CFU/ml，觀察生長狀態的變化。

    　氮源對克魯維酵母衰亡的誘導作用：取透析袋發酵（發酵4天的透析袋外側）發酵液，經10000r/min，10min離心取上清液，然后加入與新鮮培養基相同濃度的氮源，接入克魯維酵母，接種濃度為1×104CFU/ml，觀察其生長的變化。

    　釀酒酵母胞外分泌蛋白對克魯維酵母衰亡的誘導實驗：分別取發酵4天的釀酒酵母純培養和透析袋發酵（透析袋外側）發酵液，經10000r/min，10min離心取上清液，經截留分子量為10kDa的超濾膜濃縮約10倍，然后冷凍干燥成粉末，將粉末紫外殺菌后溶于無菌水中制成蛋白溶解液，最后將該蛋白質溶文章來源：cnwinenews.com解液分別加入到發酵4天的發酵上清液（透析袋外側）中，接入克魯維酵母，接種濃度為1×104CFU/ml，并觀察生產狀態的變化。

    　1.2.6 雙向電泳

　　將上述蛋白質干粉分別溶解于樣品緩沖液中，室溫下裂解1小時。將裂10000r/min 離心10min，取上清。采用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。雙向電泳采用O'FARRELL（1975）的方法。

    　1.2.7 凝膠圖像的分析

    　使用Pdquest 8.0軟件對凝膠圖像進行分析。

2結果

    　2.1 外界條件對非釀酒酵母生長的影響

    　為確定外界環境變化對克魯維酵母衰亡的影響，本實驗采用單因素實驗的方法研究各個因素在克魯維酵母衰亡中的作用，結果如圖1。由圖1可看出，增加培養基中的酒精濃度、改變培養基PH對克魯維酵母生長的影響比較小。

    　酒精（43g/L）的升高、pH（23）的改變并非誘導克魯維酵母衰亡的主要因素。與上述的2種發酵條件不同，為驗證營養物質、溶氧在克魯維酵母衰亡中的作用，實驗堆第4天透析袋外側發酵液的抑菌活力進行研究。

    　在發酵上清液中接入克魯維酵母，菌體經短暫休整后開始衰亡，培養8天后完全消失。在好氧培養時對克魯維酵母能夠存活10天，表明溶氧的增加有一定的緩解作用，但并沒有從根本上解除上清液對菌體衰亡的誘導作用，說明溶解氧不是克魯維酵母衰亡的主要因素。同樣，上清液中氮源濃度的改變在克魯維酵母的衰亡中作用也較小。