濃香型白酒的生產以泥窖窖池為基礎，發酵過程棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物群落在糟醅固、液、氣三相界面進行著復雜的物質能量代謝過程。

　　發酵過程中產生的黃水充當著窖泥與糟醅物質交換的載體，封窖發酵形成的窖內壓力變化使酒糟中的養分和來自曲藥、環境中的微生物及代謝產物，不斷通過黃水進入泥中，而窖泥中長期馴化的微生物種群及其代謝產物又不斷地進入糟醅中，物質能量交換不斷地影響著窖泥生態環境，促進了窖泥老熟和酒質的提高。
　　然而，特定的地理、氣候等環境條件造就了特定的微生物生長環境。所以，不同的酒廠生產的白酒呈現出不同的風味和品質。

    　因此，分析白酒窖池中微生物的群落結構和親緣關系，對于研究中國白酒風味因子形成機理、有效地控制生產環境條件和名優白酒生產的品質，有著積極的意義。

    　大分子rRNA及其基因rDNA已被作為一個分子指標，廣泛地應用于各種微生物的遺傳特征和分子差異的研究。把待測菌株的16SrDNA序列測定出來，然后與數據庫中的已知菌種進行比較，即可確定供試菌株的分類地位。這種方法不僅最大程度地保證結果的準確性和客觀性，而且對于微生物資源和環境的研究也有重要的價值。

    　因此，本試驗通過對分離到的細菌進行16SrDNA的序列分析，探討貴州地區濃香型白酒窖泥和酒醅中微生物的組成和系統發育情況。在本研究中，貴州地區濃香型白酒窖池中的微生物和四川境內酒廠中的微生物類群相似，但也有區別。

1 材料與方法

    　1.1主要試劑、儀器及培養基

    　PCR儀為L文章來源華夏酒報angGene MG96G；菌株DNA提取、16SrDNA片段擴增和純化所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為上海生物工程有限公司產品；企業試劑均為國產分析純。

    　牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水100ml，pH7.2—7.4，121℃滅菌20min。需要注意的是，液體牛肉膏蛋白胨培養基不加瓊脂。

    　1.2樣品的采集和菌株的分離

    　1.2.1樣品來源
    　樣品來自貴州某名酒廠盛夏生產用新窖窖池中的酒醅，發酵周期為60天，發酵正常。
　　新窖窖齡為2年，取樣時每個樣品分單糧上層、中層，多糧上層、中層不同部位采集；另外，還采集了窖泥壁、窖底泥和窖皮泥，所有樣品采集后抽真空冷凍保藏。

    　1.2.2菌株的分離
    　分別取樣，加入約1倍的滅過菌的PBS緩沖液，用渦旋振蕩器振蕩5min，于3000r/min離心5min，去上清液于10000r/min離心2min，棄上清液，沉淀重復洗滌2次，收集菌體備用。

　　用無菌生理鹽水對收集的菌體做10倍梯度的逐級稀釋，在牛肉膏蛋白胨平板上涂布分離，挑取形態有差異的單菌落，初步識別后，轉種于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基，編號保存，進行菌株的表型形狀觀察和實驗。

    　1.3菌株的初步鑒定和歸類

    　按照《伯杰氏細菌堅定手冊》（第八版）和《微生物學實驗手冊》等的鑒定方法，對所分離到的菌株進行形態學特征的觀察和生理學特征的測試。并根據所觀測到的結果對所有菌株進行歸類，將形態特征和生理學特征高度一致的歸為同一類群。

    　1.4基因組DNA的提取

    　參照《精編分子生物學實驗指南》的方法，略作修改。取1.5ml的培養菌液4000r/min離心2min；沉淀物加入565uL的DE緩沖液重懸，加入30uL10%的SDS、10uL20mg/ml的蛋白酶K和10uL10mg/ml的溶菌酶，混勻，于37℃溫浴1h；再加入NaCl和CTAB/NaCl混合液，65℃溫浴10min；然后用phenol:chloroform:Isoamyl Alcohol（25:24:1）混合液和chloroform:Isoamyl Alcohol（24：1）混合液分別進行抽提。

    　上清液加入異丙醇，混勻后于—20℃的溫度下對其沉淀30min，12000r/min離心棄上清液，最后用無水乙醇洗滌1遍，棄乙醇。向DNA沉淀中加入30uLTE緩沖液，37℃溫浴30min。

　　所得DNA溶解于TE緩沖液中，置于—20℃中保存。

    　1.5 16SrDNA和PCR擴增及測序

    　以細菌基因組DNA為模版，采用細菌16SrDNA的通用引物進行PCR擴增。

　　PCR反應的條件為：95℃預變性5min，95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸100s，共進行35個循環，最后72℃延伸10min。
　　經PCR反應擴增出16SrDNA，用PCR及酶反應產物純化試劑盒將PCR產物來進行純化后，再送交上海工程服務技術公司檢測。

2結果與分析

   　2.1菌株的生態特征和生理學特征

    從以上酒醅樣品中分離出203株細菌，窖泥樣品中分離出274株細菌，（其中窖泥壁87株、窖底泥92株和窖皮泥95株），初步鑒定這447株細菌中絕大多數是芽孢桿菌屬細菌（446株）。

    　2.2 16SrDNA的PCR純化結果

    　對分離菌株進行16SrDNA的PCR純化，已分離的芽孢桿菌屬代表菌株的16SrDNA的分子大小基本上都在1400bp—1500bp之間。

    　2.3 16SrDNA序列同源性分析

    　從20個類群中各取一株代表菌株，將其16SrDNA序列在NCBI中用BLAST進行同源性分析，結果又發現高度一致性的菌株。各類群代表菌株16SrDNA的同源性分析結果見表1。

    　由表1可看出，所有代表菌株的16SrDNA序列通過Blast檢索，都能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株的相應序列。

　　所分析的多糧窖池樣品中細菌絕大多數為芽孢桿菌，并以芽孢桿菌屬的菌株為主，占總芽孢桿菌菌數的98.43%。

    　除芽孢桿菌屬菌株之外，還分離出極少量的Brevibacillus的不確定種菌株，占已分離總芽孢桿菌菌數的1.57%。

3討論

    　在GenBank中用BLAST進行比較分析發現，從多糧窖池中分離到的芽孢桿菌與常規已知菌種都有很高的同源性。其中，將99%—100%全序列相似的判定為一個種，將97%—99%全序列相似性的判定為一個屬。根據上述標準，多糧窖池中分離到的這些芽孢桿菌大都能直接鑒定到種，只有一類菌同源性為98%，只能鑒定到屬。

    　由于微生態環境的差異和微生物長期的馴化作用使得貴州地區濃香型白酒窖池中可培養的細菌以芽孢桿菌屬為主。

    　從本實驗可以看出，如果僅僅運用傳統的微生物菌落形態和生理生化鑒定，并不能得到非常準確的結果。運用分子生物學的方法鑒定菌株能在一定程度上彌補了傳統微生物鑒定的缺陷，使相關菌株分類鑒定更加科學和符合實際。

    　在細菌類鑒定中，用16SrDNA序列分析方法鑒定菌株也一般只能鑒定到屬或種的層面上，還需要生物技術分析方法。

    　由于窖池中生態環境復雜多變，以及微生物之間的共棲關系，窖池中還有一部分包括芽孢桿菌在內的微生物無法分離培養。因此，僅僅分析可培養的微生物不能完全反映出窖池中的情況，對不可培養的芽孢桿菌的分析還需進一步探討。另外，隨著發酵時間的推移、生態環境的改變，微生物種群結構也會相應地發生變化，因此，還需要對發酵過程進行動態跟蹤。