使用木霉菌提純葡聚糖酶
β-D-葡聚糖是一種高效生物應答物(BRM)。其在免疫促進、抗腫瘤及預防糖尿病方面早已得到廣泛認可。我國啤酒工業每年產生大約4×105噸廢酵母,已有不少研究對其開展了回收蛋白質、核酸、維生素及其他可溶性營養物(用作添加劑)的實驗,但對提取酵母β-葡聚糖的研究不多。這些殘渣要么被廉價售作飼料,要么當垃圾處理,造成了環境污染。因此,提純酵母β-葡聚糖的研究意義重大。
β-1,3-葡聚糖不溶于水、酸、堿以及醇和醚等,在實際使用中廣受限制。Bao等使用化學修飾法提高了β-1,3-葡聚糖的溶解性。但該法過于劇烈,其生物活性也降低了,化學殘留與污染也成問題。β-1,3-葡聚糖酶可溫和地修飾β-1,3-葡聚糖,并保持其生物活性,使其溶于水及其他溶劑,因此,酶法降解β-1,3-葡聚糖在技術上和生物學方面都具有重大意義。同時,不同來源的β-葡聚糖酶已被證實具有不同活性。胞外葡聚糖酶已成功地從真菌如Cladorrhinum foecundissimum,Talaromyces emersonii和Rhizopus oryzae中提取。
粗酶提取的方法為:取固態發酵培養基,加入NaAc緩沖液于室溫下浸提,用沃特曼濾紙過濾殘余菌絲和顆粒。濾液在高速冷凍離心機中離心,上清液即為β-1,3-葡聚糖粗酶。
粗酶純化方法為:粗酶液中添加(NH4)2SO4,在冷凍沉降機中離心,取沉淀溶于NaAc緩沖液,裝透析袋透析。使用乙二醇(PEG600)脫水濃縮沉淀,DEAE-瓊脂糖凝膠 CL-6B柱層析,洗脫液分別收集并脫水濃縮。
經SDS-PAGE分析,該酶分子量近似54.6KD。酶最適反應pH為5.0,最適溫度為50℃。在pH3.0-5.0、溫度30℃-70℃之間酶活相對穩定。Fe3+、Mg2+、Mn2+以及Cu2+對該酶有抑制作用,Zn2+、Cav和Fe2+則有激活作用。底物選擇性研究表明,該酶為β-1,3、β-1,4-葡聚糖酶,可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷鍵的底物,對含α-1,4和α-1,6糖苷鍵的底物無作用。
