一、方法原理

　　1 外標法

　　外標法，又稱校正曲線法，指在相同分析條件下，用已知的標準品配成不同濃度的標準溶液，測量各種濃度的峰高或峰面積，以繪制響應信號與濃度的關系曲線。在同樣條件下，測量樣品的峰高或峰面積，在校正曲線上查出其對應的樣品濃度；或利用樣品和標準峰高、峰面積，根據回歸曲線方程計算出對應的樣品濃度。

　　2 內標法

　　內標法，指在樣品中加入內標物，利用被測物與內標物校正因子的比值不變來進行定量。用已知的標準品和內標物配成不同濃度的標準溶液，求得校正因子比值；用測量樣品的峰高、峰面積和校正因子比值計算出樣品濃度。

　　二、材料與方法

　　1 儀器裝置

　　Varian氣相色譜儀配有FID檢測器；

　　AutoHs自動頂空采樣儀；

　　電子天秤（0.0001），微量自動吸樣器、100mL容量瓶、1mL刻度吸管。

　　2 材料和試劑

　　色譜純試劑分別為：無水乙醇、5%乙醇、乙醛、異戊醇、正丙醇、異丁醇、甲醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、甲酸乙酯、DMS

　　3 色譜條件

　　毛細管柱：DM-WAX色譜柱（30m×0.53mm×2ｕm）。

　　進樣口溫度：200℃；檢測器溫度：230℃；載氣：氮氣（6mL/min）分流比1：10。

　　色譜柱升溫程序：40℃保溫3min，10℃/min升溫至90℃保溫1min，30℃/min升到220℃保溫3min。

　　4 內標液的配制

　　4.1 準確稱取正丁醇原液20.0g于100mL容量瓶中，用色譜純無水乙醇定容于100.0mL，此為內標原液。

　　4.2 取1.0mL內標原液+4.0mL色譜純無水乙醇用重蒸水稀釋至100.0mL（2000PPM），此為內標使用液。

　　5 風味成分混合原液的配制（見表1）

　　5.1 稱取表1所列次序的各風味物質于100mL容量瓶中，用色譜醇無水乙醇定容搖勻，再吸取1mL混合。

　　標準于100mL容量瓶中定容，之后再稀釋100倍即為我們所需標準。

　　6 試驗方法

　　6.1 內標法

　　6.1.1 內標方法的建立

　　取5mL混標移入20mL頂空瓶中，加入0.1mL內標液，將瓶塞密封，在頂空進樣器中55℃保溫30min。在3色譜條件下頂空進樣分析，用內標法校正，建立內標方法（見圖1）。

　　6.1.2 樣品測定

　　取室溫下的啤酒樣品5mL移入20mL頂空瓶中，加入0.1mL內標液，同上頂空進樣分析，加載6.1.1已經建立的內標方法計算出樣品中各風味物質的濃度。

　　6.2 外標法

　　6.2.1 外標方法建立

　　取5mL混標，瓶塞密封，在3色譜條件下頂空進樣分析，用外標法校正，建立外標方法，計算出各組分的校正系數，保存方法備用。氣相色譜法外標法測定啤酒風味物質標樣（見圖2）。

　　6.2.2 樣品測定

　　取室溫下的啤酒樣品5mL移入20mL頂空瓶中，同上頂空進樣分析，加載6.2.1已建立的外標方法計算樣品中各組分的濃度。

　　三、結果與討論

　　1 精密度和重復性試驗

　　1.1 內標法精密度和重復性實驗

　　取同一濃度混標按內標法進行三次重復檢測（見表2）。

　　從表2可以看出，用內標法測定的結果變異系數均小于3%，說明該方法精密度和重復性都很好，符合氣相色譜微量分析的要求。

　　1.2 外標法精密度和重復性試驗

　　取同一濃度混標按外標法進行三次重復檢測（見表3）。

　　從表3可以看出，用外標法測定結果變異系數相比內標法均偏高，但均小于3%。說明該方法的精密度和重復性較好，符合氣相色譜微量分析的要求。

　　2 回收率試驗

　　2.1 取5.0mL樣品+0.1mL混標+0.1mL內標使用液，用內標法進行測定，計算回收率（見表4）

　　從表4可以看出，同一樣品回收率測定結果均在90—105%之間。在色譜分析中是可以接受的，可以滿足日常分析要求。

　　2.2 取5.0mL樣品+0.1mL混標，用外標法進行測定，計算回收率（見表5）

　　從表5可以看出，同一樣品回收率測定結果均在90—105%之間，在色譜分析中是可以接受的，可以滿足日常分析要求。

　　3 不同公司樣品用外標法和內標法的測定結果（見表6）

　　從表6可以看出，同一樣品用不同的方法檢測得出的結果有所偏差，尤其是含量較大的，如乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇等偏差較大。所以在選擇方法時，應根據實際情況選擇適宜的方法。

　　圖3和圖4是氣相色譜法檢測百威10.5度啤酒風味物質內標法和外標法色譜圖。

　　4 混標放置時間長短對內標法檢測結果的影響

　　4.1 混標放置時間長短對內標法檢測結果的影響（見表7）

　　從表7可以看出，放置時間越長，檢測結果差別越大，特別是如乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇和異戊醇等含量較大的物質，隨著放置時間長短的不同，測定結果會隨之升高。

　　4.2 混標放置時間長短對外標法檢測結果的影響（見表8）

　　從表8可以看出，和內標法一樣，隨著放置時間越長，檢測結果差別越大，特別是如乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇和異戊醇等含量較大的物質，隨著放置時間長短的不同，測定結果隨之升高，導致測定結果誤差較大。

　　5 外界環境溫度對內標法檢測結果的影響

　　5.1 外界環境溫度對內標法檢測結果的影響（見表9）

　　從表9可以看出，儀器室內溫度越高，檢測結果越不穩定，同時，乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇和異戊醇等含量較大的物質隨室內溫度的升高，測定結果亦隨之升高。

　　5.2 外界環境溫度對外標法檢測結果的影響（表10）

　　從表10可以看出，儀器室內溫度越高，檢測結果越不穩定。同時，乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇和異戊醇等含量較大的物質隨室內溫度的升高，測定結果隨之升高。

　　四、結論

　　1.用內標法和外標法測定啤酒中風味物質精度都可以達到要求，切實可行。

　　2.外標法操作比較簡單，內標法操作比較繁瑣。每次都需要添加內標液，但用內標法測定的結果比外標法要低，誤差小。尤其對于含量較高的醇和酯，用內標法比外標法結果誤差小。所以如果進行科研，則采用內標法較準確；如果用于工業生產，則采用外標法相對方便易行。但無論用何種方法比較數據，都要在相同的方法和相同的條件下比較，否則就沒有可比性。

　　3.無論是用內標法還是外標法，樣品放置時間的長短都會對結果產生較大的影響。放置時間越長，測定結果的誤差越大。主要原因是由于放置過程中環境對其影響較大。另外，因取樣時取樣瓶中混入氧氣，也會對部分物質如乙醛等產生不利影響，主要是因為大部分啤酒企業在啤酒過濾時添加亞硫酸鹽等抗氧化劑，其分解的SO2（也包括啤酒發酵時產生的）能與乙醛形成加合物，可以減少游離乙醛的含量。但當SO2被啤酒中溶解氧氧化后，乙醛又會游離出來。這就是啤酒在放置一段時間后，乙醛含量比最初升高的原因，使乙醇發生可逆反應。生成乙醛放置時間的長短，對乙醛、乙酸乙酯、異戊醇測定結果影響較大。

　　4.不管采用哪種方法，環境溫度對做樣結果影響都比較大。溫度越高，測定結果就偏高。因此在夏天做樣時，須分批將樣品放入，不可一次將一天的樣品同時放置于取樣器樣品盤上，暴露于環境溫度下。如果條件允許的話，最好在室內安裝空調，將溫度穩定在20℃做樣。 如果確需將樣品一次取完，可將樣品先放置于0—4℃的冷藏下放置，在做樣之前取出，放到進樣器設好的位置。這樣可使結果更準確可靠。

　　五、注意事項

　　1.保證進樣量、色譜分析條件嚴格不變。

　　2.做樣前，將取樣瓶和瓶蓋在烘箱中烘烤30min，冷卻后使用。

　　3.樣品在密封入取樣瓶后，盡快分析檢測，不宜放置時間過長，防止氧化使檢測結果偏高。

　　4.為保證做樣準確，減少誤差，樣品最少要做3個以上的平行樣，取三個樣品的平均值，測定結果會更準確，誤差更小。

　　5.標準樣品使用完之后，密封嚴實在冰箱0—4℃條件下保藏，防止揮發。

　　6.建議標準樣品使用一個月后，重新配制。

　　7.標準方法應定期校正新建，以保證測定結果的準確性。