黃酒是世界上最古老的酒種，其獨特的發(fā)酵工藝在世界釀酒中獨樹一幟，加上悠久的歷史底蘊，被譽為“天下一絕”。黃酒自古以來就有“欲釀酒必先制曲”的說法，紹興酒釀造中更是把曲形象地稱為“酒之骨”。可見曲對酒質(zhì)具有極其重要的作用。
    　曲的主要作用有三個方面：一是為酒母和醪提供酶源，使原料中的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等溶出和分解；二是在曲菌繁殖和產(chǎn)酶的同時，產(chǎn)生葡萄糖、氨基酸、維生素等成分，這是酵母的營養(yǎng)來源，并生成有機酸、高級醇及脂類成分；三是曲香及曲的其他成分作為酒的前體物質(zhì)賦予酒以獨特的風(fēng)味。
    　本文以本公司技術(shù)中心保藏的米曲霉為菌種，研究了培養(yǎng)條件與種曲產(chǎn)孢子數(shù)的關(guān)系，與黃酒同行共同探討、學(xué)習(xí)。
    　1.材料和方法
    　1.1 實驗菌種
    　公司技術(shù)中心保藏的黃酒釀造用米曲霉菌種，采用麩皮試管形式保藏。
    　1.1.1 實驗儀器
    　顯微鏡       JNO EC XS-212-201 上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠
    　血球計數(shù)板  （XB-4-25）        上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠
    　超凈工作臺   SB-JC-1A          上海博迅實業(yè)有限公司
    　濕熱滅菌鍋   YXQ-SG46-280SA  上海佳勝實驗設(shè)備有限公司
    　霉菌培養(yǎng)箱   MJX-250B I型     上海博迅實業(yè)有限公司
    　1.2 培養(yǎng)基
    　1.2.1 分離培養(yǎng)基：蛋白胨  1.75g；瓊脂粉  5g；可溶性淀粉  7.5g；水  250ml。
    　1.2.2 米曲汁斜面培養(yǎng)基：10—12。BriX米曲汁500ml；瓊脂 10g。
    　1.2.3 麩皮試管培養(yǎng)基：采用麩皮為原料，加水55%－60%，每支裝入試管的1/4，121℃滅菌30min。
    　1.3 實驗方法
    　1.3.1 米曲霉菌種的分離、純化
    　實驗所用菌種為上一年保藏的菌株，性能可能發(fā)生衰退，活性減弱，因而必須對其進行純化復(fù)壯，使其保持較強的生長繁殖能力和較高的酶活力。采用透明圈法挑選性能優(yōu)良的菌種，轉(zhuǎn)接入米曲汁斜面試管，30℃恒溫培養(yǎng)4天，待孢子濃密時，置4℃冰箱中，備用。
    　1.3.2 米曲霉種曲的培養(yǎng)及分析
    　將麩皮用20目/寸篩過篩，篩去粉末，否則經(jīng)蒸煮后會出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，造成培養(yǎng)時透氣性不好。按實驗設(shè)計進行配料，裝入500ml三角瓶中，扎牛皮紙包口于濕熱滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30min。取出后趁熱搖散培養(yǎng)基，以防結(jié)塊。自然冷卻至室溫。
    　取培養(yǎng)好的米曲汁斜面試管1支，無菌條件下接種到500ml三角瓶培養(yǎng)基中1環(huán)，充分搖勻。放入30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，經(jīng)16 -20小時，麩皮上略長白色菌絲，根據(jù)生長情況每隔4小時左右搖瓶一次，若干次后根據(jù)生長情況將麩皮平攤瓶的底部。再經(jīng)10小時左右麩皮連接成餅狀，要求能扣則扣瓶。輕扣輕放后繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12小時復(fù)扣一次，至接種后取出進行分析。
    　分析方法：取干燥種曲0.2g，用100ml無菌水稀釋，充分振蕩搖勻，取中間液層，用血球板記數(shù)法測其孢子數(shù)，每瓶做兩次重復(fù)。
    　2.結(jié)果與分析
    　2.1 菌種的分離純化
    　透明圈法是常用的菌種分離純化方法。對米曲霉菌落的透明圈比值進行測定，結(jié)果見表1。
    　由表1可以看出，當菌落稀釋到10-4至10-7，菌落彼此分離，為單孢子菌落。挑選透明圈比值較大的分離出的菌落為優(yōu)質(zhì)純化菌落。
    　將單孢子菌落轉(zhuǎn)接于米曲汁斜面試管中，于30℃恒溫條件下培養(yǎng)4天，待孢子濃密時取出，置于4℃冰箱中備用。
    　2.2 加水量對種曲質(zhì)量的影響
    　水是一切生物活動的載體，種曲培養(yǎng)過程中米曲霉需以體外吸收養(yǎng)分，而養(yǎng)分又必須先被水所溶解，在其生長過程中又需耗掉大量的水分。本實驗設(shè)計含水量70%、75%、80%、85%、90%五個梯度，接種孢子后于30℃恒溫培養(yǎng)72小時。加水量對種曲孢子數(shù)的影響如圖2所示。
　　由圖2可知，加水量對種曲質(zhì)量有顯著的影響，隨著培養(yǎng)基料中加水量的增大，種曲產(chǎn)孢子數(shù)呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢。加水量為80%~85%時，曲料比較松散，米曲霉生長旺盛，產(chǎn)孢子數(shù)為最高，是適宜的加水量。曲料中加水量過少（<80%），曲料缺乏水分，米曲霉對原料利用不夠充分，繁殖能力降低，因而產(chǎn)孢子數(shù)較少；但曲料中的水分過多（>85%），曲料就會粘結(jié)成團塊，引起局部散熱困難，造成曲料溫度不均勻，導(dǎo)致米曲霉生長不理想，從而影響種曲質(zhì)量。
    　2.3 培養(yǎng)時間對種曲質(zhì)量的影響
    　種曲培養(yǎng)時間對種曲質(zhì)量有影響，過篩的新鮮麩皮80%左右的水充分拌勻，分裝于500ml的三角瓶中，上棉塞包扎牛皮紙，0.1MPa濕熱殺菌30min，趁熱搖散瓶中熱塊，冷卻后在無菌條件下接入試管斜面米曲霉孢子，充分搖勻。種曲培養(yǎng)時間與產(chǎn)孢子數(shù)的關(guān)系見圖3。
    　由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，米曲霉產(chǎn)孢子數(shù)呈增大趨勢。在72小時后孢子數(shù)趨向平穩(wěn)。
    　3.小結(jié)
    　本次實驗驗證了種曲培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的加水量和培養(yǎng)時間對種曲產(chǎn)孢子數(shù)的影響，確定了在黃酒種曲生產(chǎn)過程中培養(yǎng)基含水量和培養(yǎng)時間，對生產(chǎn)有很大的幫助。其余麩皮的質(zhì)量等因素尚有待于進一步實驗。