石榴果酒酵母的分離及發酵工藝
為了得到發酵石榴汁的優良菌種，并確定石榴酒發酵的工藝參數，從自然發酵的石榴酒醪中分離、純化石榴酒酵母菌種；通過單因素和正交試驗，確定石榴酒發酵的工藝參數。
結果發現，分離純化的菌種經形態特征和26S rDNA D1/D2 區域序列分析鑒定為釀酒酵母。由此確定的最佳工藝條件為：溫度28℃、pH 3.8、糖度為17%、二氧化硫的添加量為100 mg/L，最終發酵的石榴酒的酒度在10%VoL左右。
石榴酒是以石榴為原料，經剝皮、榨汁、發酵、澄清、陳釀而成的果酒。其色澤光亮透明，酒體純正，酸甜爽口，保留了石榴酸、甜、澀、鮮之天然風味，含有大量氨基酸、多種維生素等，具有很高的營養價值，并有生津化食、健脾益胃、降壓降脂、軟化血管、保健美容及止瀉之功效。
經發酵過的石榴汁抗氧化活性與丁基羧基茴香醚（BHA）相近，明顯高于紅葡萄酒。中國石榴種植面積迅速擴大，尤其是河南滎陽、衛輝等地形成了大的石榴園，產量已具規模，但是石榴不耐儲藏，除鮮食外，每年都有許多果實因不能及時消費和加工而浪費，特別是小果和裂果。
近年來，從天然石榴汁中分離得到了一株高效發酵石榴酒的菌株，通過形態特征和26S rDNAD1/D2 區域序列分析鑒定為釀酒酵母系列。對其發酵工藝參數進行優化，獲得了酒體純正生物功效高的石榴酒生產最佳工藝，并探討了石榴的綜合利用，增加了石榴及其他相關農產品的附加值。對提高石榴經濟效益，保護和發展石榴產業有著非常重要的意義。
1 材料與方法
1.1 材料
石榴：購自河南省新鄉市衛輝。菌種：從石榴汁自然發酵醪中分離。分離及保藏培養基：馬鈴薯20%，蔗糖1%，石榴汁40%，瓊脂2%。菌種鑒定材料：引物NL1（5’—GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG—3’）和NL4（5’—GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3’），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。酵母基因組DNA提取試劑盒（Solarbio 公司），PCR buffer、Tag 酶、dNTP（寶生物工程（大連）有限公司）。
1.2 主要儀器
PCR儀為T—Gradient （德國Biometra公司）。
1.3 方法
1.3.1 菌源的制備取壓榨好的石榴全汁置室溫進行自然發酵，使石榴汁內的酵母大量繁殖，待有大量氣泡并有較濃酒味產生時，即可供分離石榴酒菌源。
1.3.2 菌種的分離、純化取上述發酵好的石榴酒醪進行梯度稀釋，均勻涂布至分離用的瓊脂培養基上，22℃—24℃恒溫培養36h，挑單菌落培養直至純化。
1.3.3 菌種的鑒定純化后的菌株經菌落形態觀察和鏡檢，初步確定為酵母菌。同時，根據酵母菌分類學研究標準方法做分子鑒定。酵母核基因組的提取使用酵母基因組DNA提取試劑盒，按照說明書操作。
使用引物NL1和NL4進行26S rDNA D1/D2區的擴增。PCR 反應液的組成（采用50μL體系）：每管中含PCR緩沖液（10×）5.0μL；25mmol/LMgCl2 3.0μL；10mmol/LdNTP1.0μL；10μmol/LNL1 和NL4 各1ul；0.5 U/ul DNA 聚合酶0.3 μL；10ng/ul —1000ng/ul 模板DNA1.0μL；最后添加ddH2O 定容50μL。PCR循環次序為：95℃預變性5min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min20s；循環36次；再72℃延伸8 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由英俊生物技術有限公司測序。
1.3.4 發酵工藝的確定
發酵溫度的確定。
將石榴汁的糖度調整為19%，pH調為4.0，添加SO2量為80mg/L。接種等量的石榴酒酵母，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃5個溫度梯度下培養。待不再有氣泡產生時停止發酵，用來測定其殘糖和酒精度。
發酵pH的確定。
將石榴汁的糖度通過添加蔗糖調整為19%，添加SO2量為80mg/L，調pH分別為3.8、4.1、4.4、4.6、4.8，接種等量的石榴酒酵母，置于28℃下發酵。待不再產生氣泡時停止發酵，測定其殘糖和酒精度。
不同糖濃度發酵的試驗。
利用蔗糖，將石榴汁的糖度分別調整為13%、15%、17%、19%、21%5個梯度，添加SO2量為80mg/L，調節pH為4.0，接種等量的石榴酒酵母。置于28℃下發酵。待不再產生氣泡時停止發酵，測定其殘糖和酒精度。
SO2添加量的確定。
將石榴汁糖度調整為19%，pH調為4.0，分別選擇SO2的添加量為40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L。接種等量石榴酒酵母，置于28℃下發酵。待不再產生氣泡時停止發酵，測定其殘糖和酒精度。正交試驗因素水平測試。以溫度、pH、糖度、SO2的添加量為因素，進行L9（34）正交試驗（見表1），以確定各因素的最佳用量。
2 結果與分析
2.1 石榴酒酵母的分離鑒定
從自然發酵的石榴酒醪中分離出的酵母的菌落形態可以看出，所分離菌種的菌落形態特征為：菌落乳白色，圓形較大，中間突起，濕潤有光澤，邊緣成浸潤狀。經鏡檢其細胞為橢圓型，能進行出芽繁殖，符合果酒酵母的典型特征。
經BLAST分析及序列相似性計算，所分離出的被測菌株的26S rRNAD1/D2 區基因序列與模式菌株（U44806）同源性為99.4%，被鑒定為釀酒酵母。
2.2 發酵條件單因素試驗結果
在適宜的溫度、pH、糖濃度下，酵母菌的生長繁殖和代謝速度都很迅速，較低的pH還可以保證添加的SO2以較多的游離態存在，更好地起到抑制有害微生物的作用。因此，試驗對上述參數進行了單因素試驗。
通過發酵過程觀察發現，發酵溫度高，發酵完成快，殘糖高，酒精度低，果酒風味不足；發酵溫度低，發酵完成較慢，殘糖低，酒精度也高。
從不同溫度下發酵樣品的殘糖和酒精度結果來看，26℃是最適的發酵溫度。
由不同pH下發酵樣品的殘糖和酒精度的結果可以看出，不同pH對石榴酒發酵結束的殘糖幾乎沒有影響，在pH4.6時殘糖較低，但酒精度也低。在pH3.8時產酒精度最高，在pH超過4.4時雖然也能達到相同的酒精度，但發酵后石榴酒的顏色發黃，失去了原本的深紅色，影響石榴酒的外觀效果。因此，確定石榴酒酵母發酵的最適為pH3.8。由不同糖濃度下發酵的樣品的殘糖和酒精度的結果可以看出，隨著發酵初糖的提高，發酵結束時的殘糖也隨之增加，而最終酒精度也逐漸隨之增加，在糖度為19%時達到最大，而后又開始下降。
因此，并不是糖度越高，酒精的轉化率就越高，過高的糖度可能會抑制酵母菌對糖的利用。這可能是糖度過高時，酵母菌所處環境的滲透壓超出了其所耐受的能力，從而抑制了其生理活動。
從試驗結果來看，石榴酒酵母發酵的最適糖度為19%。在果酒釀造過程中都會添加一定量的SO2，起到抑制雜菌、護色、澄清、增酸和改善口味等作用。但添加過多會影響酒的風味、抑制酵母菌的發酵及出現酒液中殘留硫量超標等危害。由SO2對石榴酒發酵結束的殘糖和酒精度的影響可看出，SO2對石榴酒發酵結束時的殘糖濃度幾乎沒有影響，對最終酒精度的影響也較小，均為6%左右，而添加量為80mg/L 時酒精度稍高一點，為6.1%。
2.3 正交試驗結果
發酵溫度、pH、糖度（%）和SO2的添加量（mg/L）4因素正交試驗結果見表2。
由表2 可以看出，對酒精度影響程度的主次順序為糖度（C）＞ 溫度（A）＞pH（B）＞SO2的添加量（D），即糖度、溫度和pH 對石榴果酒的酒精度影響較大，而SO2的添加量對石榴酒酵母發酵的影響較小，其最優方案為A2B1C1D3，即溫度為28℃，pH為3.8，糖度為17%，SO2的添加量為100mg/L時，石榴酒酵母發酵石榴汁產酒度最好。
3 結論
研究從自然發酵的石榴酒醪里分離出了一株能高效發酵石榴汁的酵母菌種，通過基因組分析初步鑒定為釀酒酵母。
通過正交優化試驗，獲得了最佳石榴酒釀造條件，并確定了釀造過程中影響酒精度因素為糖度＞溫度＞pH＞二氧化硫添加量。
石榴酒艷若朝霞，果香純正，優雅，更因其獨特的食療保健作用，極具發展潛力，發展果酒符合國家產業政策的要求。而做好研究為石榴酒規模生產提供了重要參考。大力發展石榴果樹栽培，選育優良品種，對開發石榴酒等系列產品很重要。
表1 正交試驗因素水平
表2 石榴酒發酵工藝的正交試驗結果
